德國(guó)徠卡共聚焦顯微鏡常見問題診斷維修
1、掃描Z終圖像清晰度不高
造成此類問題的原因主要有兩個(gè)：
①物鏡和ZOOM值選用不正確：
初學(xué)使用者大多喜歡選用共聚焦顯微鏡10x物鏡后，再將ZOOM值調(diào)到所需要的Zda值。通過ZOOM值的增大確實(shí)可以將圖像放大，有助于看清圖像的細(xì)節(jié)，但是ZOOM的增大是有限定的，這取決于物鏡的倍率。例如在10x物鏡下，ZOOM值超過10就沒有意義了，而且ZOOM值的增大屬于電子放大，放大倍數(shù)越高，清晰度越差。所以在所觀察的樣本形態(tài)體積較小的情況下，多采用高倍物鏡(例如63x水鏡或油鏡)，再適當(dāng)調(diào)整ZOOM值，ZOOM值Z好不超過2。
②誤將Z-Position旋轉(zhuǎn)球的功能和共聚焦顯微鏡焦距微調(diào)旋轉(zhuǎn)器的功能等同：
在準(zhǔn)確調(diào)焦的基礎(chǔ)上，通過Z-Position旋轉(zhuǎn)球的左右調(diào)節(jié)，可以觀察到目標(biāo)樣品圖像由Z軸距離變化而引起的圖像清晰度的改變，感覺上和通過調(diào)焦使圖像變清晰一樣。因此很多使用者在沒有調(diào)焦準(zhǔn)確的情況下，直接使用-Position旋轉(zhuǎn)球來調(diào)整圖像清晰度而導(dǎo)致成像模糊。
2、掃描背景強(qiáng)，圖像質(zhì)量差
解決這個(gè)問題的關(guān)鍵在于要根據(jù)樣品的制備質(zhì)量選取合適的針孔大小，調(diào)整激光管電壓、光電倍增管功率、信噪比等參數(shù)到Z佳狀態(tài)。這些參數(shù)或設(shè)置有非常密切的關(guān)系，選擇時(shí)應(yīng)該綜合考慮。
還有一種明場(chǎng)出現(xiàn)環(huán)狀波紋背景的情況是由于操作者在使用共聚焦顯微鏡觀察熒光樣品后，沒有將熒光濾鏡退出并切換到掃描狀態(tài)所致。此時(shí)只需要轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)輪至Scan即可。
3、串色
在使用多種熒光染料標(biāo)記樣品時(shí)或是樣品本身有很強(qiáng)的自發(fā)熒光時(shí)，串色的現(xiàn)象就很容易發(fā)生。串色又分為兩種情況：
①兩種熒光染料的激發(fā)光譜沒有重疊，但是吸收光譜有重疊。這類串色可以通過順序掃描(又稱序列掃描)來完成：即先使用一種熒光染料的激發(fā)光掃描一張圖片，再使用另外一種熒光染料的激發(fā)光掃描第二張圖片。
②兩種熒光染料的激發(fā)光譜和吸收光譜都有重迭，這種情況只能通過光譜掃描解決。
4、多熒光通道掃描圖像的保存及標(biāo)尺數(shù)值的取整
在多通道掃描圖像存盤時(shí)，共聚焦顯微鏡系統(tǒng)默認(rèn)以不同單通道的顏色分別保存。為了便于直觀的觀察各種熒光在不同部位的表達(dá)，我們還需要一張各種熒光疊加的合并圖像，此時(shí)點(diǎn)擊Overlay鍵即可。在單次掃描圖像完成后，共聚焦顯微鏡系統(tǒng)自動(dòng)生成的標(biāo)尺數(shù)值多數(shù)情況下為非整數(shù)，即使在圖像保存前修改為整數(shù)，但一經(jīng)后續(xù)掃描，前幅圖像中修改過的標(biāo)尺數(shù)值又會(huì)恢復(fù)到默認(rèn)的非整數(shù)值。
解決這個(gè)問題也需要用到Overlay能鍵，即在單次掃描完成并將標(biāo)尺數(shù)值修改取整后，點(diǎn)擊Overlay鍵顯示合并圖像，再右鍵點(diǎn)擊選中圖片，使之生成Snapshot圖像即可。這兩點(diǎn)是初學(xué)使用者很容易忽視的。
5、在圖像掃描完成后，各種參數(shù)忘記復(fù)位
特別是電子放大掃描以后，很多操作者都忘記將共聚焦顯微鏡ZOOM還原，這就造成在下一個(gè)樣品掃描時(shí)無法在顯示屏上觀察到目標(biāo)樣本。
上海仰光電子--精密儀器儀表維修中心
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